使用前经过清洁消毒，培养皿清洁与否对工作影响较大，可影响培养基的酸碱度，若有某些化学药品的存在，会抑制细菌的牛长。新购的培养皿应先用热水冲洗，再置于质量分数为1％或2％的盐酸溶液中浸泡数小时，使游离碱性物质除去，再用蒸馏水冲洗2次。若要培养细菌，再用高压蒸气(一般6.8×10⑤次Pa高压蒸气)，120℃的温度下30min灭菌，置室温中干燥，或用干热灭菌，就是将培养皿置于烘箱内，温度控制在120℃左右的情况下维持2h，即可杀死细菌的胞芽。经过消毒的培养皿才能接种培养使用。
    培养皿通常使用固体培养基制成平板培养(就是平板皿名称的由来)，平板培养基制作是将已装好的灭菌琼脂培养基，用温水(无菌)溶化，取下试管的棉花塞，管口于酒精灯火焰上通过，然后微启灭菌的培养皿盖，使试管口能深入为宜，倾入培养基后即可盖密，再轻轻地摇匀倾入的培养基，使之均匀地分布于皿底上凝结，即得平板培养基。由于细菌的繁殖、发育生长是与所供给的培养基(营养)有直接关系，尤其是作定量检验分析，对提供营养物的多少，有决定意义。细菌培养时对营养物提供的多少、是否均匀，培养皿皿底是否平整极为重要，如培养皿皿底不平，琼脂的培养基分布将随培养皿皿底是否平整而有厚有薄，薄的部分营养供给就不足，这对定量分析有着密切关系，故对定量培养皿皿底要求特别平整的原因所在。但作一般定性(检验细菌、菌落生长、繁殖等)，使用普通培养皿即可。
    细菌的分离培养，一般标本中常同时混有数种细菌，如口腔咽喉菌及耳朵的分泌物、痰液、小便、大便等，凡需研究的细菌，须先用分离培养法，使其成为纯种培养，通过对细菌作纯种培养，用肉汗加2％琼脂的固体培养基，经保温漏斗以脱脂棉花过滤，注入试管中，二天后检验无新菌，再投入培养皿内，先制成平板，在无菌的条件下进行接种，接种后把培养皿倒置移入25～30℃的恒温箱内(倒置是避免水蒸气凝成液滴滴入皿底内，影响菌落的生长)，通过培养进一步观察细菌的形态和色泽，研究致病的病菌，以及对它防治的效果。
    培养皿使用面广、用量大。一般防疫站、医院等单位多用90～lOOmm规格，农科院、
水产研究院多用120mm以上的大规格。